Laporan
Praktikum ke-3 Hari/Tanggal : Rabu/28 Maret 2012
m.k.
Dasar-dasar Genetika Ikan Kelompok :
I
EKSTRAKSI
DNA
Dian
Eka Ramadhani
C14100003
TEKNOLOGI DAN MANAJEMEN PERIKANAN
BUDIDAYA
DEPARTEMEN
BUDIDAYA PERAIRAN
FAKULTAS
PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT
PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
I.
PENDAHULUAN
1.1.Latar
Belakang
Ekstraksi DNA
adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis
DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang
pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter
sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi
DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan
tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan/tissue
(termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan bagaimana
sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak. Metode untuk isolasi asam
nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran mekanik atau metode kimiawi,
yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi manual maupun
otomatis yang digunakan, kita harus berhati-hati untuk meminimalisir degradasi
DNA, dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya, freeze-thaw
yang berulang-ulang dan vortex. Selanjutnya, laboratorium harus diatur
sedemikian rupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang diantara
sample (sciencebiotech.net).
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu reaksi in vito untuk
menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis
molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut melalui
bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai
primer dalam suatu thermocycler. Panjang target DNA
berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang
primer. Primer yang berada sebelum daerah target disebut forward dan yang berada setelah daerah target disebut reverse. Enzim yang digunakan sebagai
pencetak rangkaian molekul DNA baru dikenal sebagai enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik
PCR diperlukan dNTPs yang mencakup dATP (nukleotida berbasis Adenin), dCTP (Cytosine), dGTP (Guanine)
dan dTTP (Thymine) (Muladno, 2010).
Secara ringkas, prinsip
pelipatgandaan jumlah molekul DNA pada target yang diinginkan melalui teknik
PCR dapat dijelaskan sebagai berikut. Pada suhu 950 C, molekul DNA
mengalami denaturasi sehingga struktur berubah dari untai ganda menjadi untai
tunggal. Pada suhu berkisar antara 500 C sampai 600 C, primer, forward yang runutan
nukleotidanya berkomplemen dengan salah satu untai tunggal akan menempel pada
posisi komplemennya. Demikian juga primer
reversenya akan menempel pada untai tunggal lainnya. Setelah kedua primer
tersebut menempel pada posisinya masing-masing enzim polymerase mulai mensintesis
molekul DNA baru yang dimulai dari ujung 3’ nya masing-masing primer pada suhu
720 C. Proses ini disebut ekstensi. Dengan demikian, satu molekul
DNA ganda akan berlipat jumlahnya menjadi dua molekul DNA. Setelah itu diulangi
proses denatuasi, penempelan, ekstensi yang disebut sebagai satu siklus. Proses
PCR biasanya berlangsung 35-40 siklus (Muladno, 2010).
Random
Amplified Polymorphic DNA (RAPD) merupakan salah satu maka molekuler
berbasis PCR yang banyak digunakan dalam mengidentifikasi keragaman pada
tingkat intraspesies maupun antarspesies (Qian et al,. 2001, Adam et al,.2002,
Jena dan Das, 2006). Teknik ini mendeteksi polimorfisme ruas nukleotida pada
DNA dengan menggunakan sebuah primer tunggal yang memiliki rangkaian nukleotida
acak. Pada reaksi PCR-RAPD ini, sebuah prime menempel pada DNA genomic pada dua
tempat berbeda dari DNA komplementer. Jika tempat penempelan primer ini berada
pada daerah yang dapat diamplifikasi, maka hasil DNA tertentu yang dihasilkan
melalui amplifikasi siklus termal. Umumnya masing-masing primer menyebabkan
amplifikasi beberapa lokus (Welsh dan McClelland, 1990, Williams et al ., 1990).
Walaupun metode RAPD relatif cepat,
murah dan gampang dilaksanakan dibandingkan metode marka DNA lain, konsistensi
atau reproducibility hasil PCR
menjadi perhatia sejak dipublikasikannya teknik ini. Primer RAPD dapat tidak
cocok secara sempurna pada urutan penempelan primer, akibatnya amplifikasi pada
beberapa siklus mungkin tidak terjadi, sehingga band tetap samara tau bahkan
amplifikasi tidak terjadi jika primer tidak berhasil menempel pada DNA cetakan
(Lamboy,1994). Hal tesebut dapat diakibatkan karena tidak tepatnya konsentrasi
komponen-komponen PCR-RAPD. Disamping itu, kualitas DNA cetakan juga
berpengaruh. Adanya kandungan polifenol dan metabolit akunder lain sepeti
tannin, terpen dapat menurunkan kemurnian DNA dan menghambat menempelnya primer
(Padmalatha dan Prassad, 2006).
II.
HASIL
Berikut ini
adalah hasil praktikum anaisis DNA dengan teknik PCR-RAPD pada masing-masing
spesies yang diamati :
Tabel 1. Pengukuran DNA melalui teknik PCR-RAPD
|
B1
|
B2
|
M1
|
M2
|
G1
|
G2
|
N1
|
N2
|
Rasio
|
1.72
|
2.358
|
1.991
|
1.991
|
1.724
|
1.639
|
1.9
|
2.09
|
DNA (µL/ml)
|
264
|
48
|
112
|
112
|
208
|
72
|
40
|
200
|
P (%)
|
96
|
130
|
109
|
110
|
95
|
91
|
106
|
110
|
Keterangan
:
P
: purity B : betok M : mas
G
: gurame N : nila
Berdasarkan tabel diatas dapat diketahui bahwa rasio
paling tinggi terdapat pada ikan betok 2 sebesar 2.358 dan terendah pada ikan
gurame 2 sebesar 2.639. jumlah DNA (µL/ml) terbesar pada betok 1 sebesar 264 (µL/ml) dan
terendah pada ikan nila 1 sebesar 40 (µL/ml). Sedangkan purity tertinggi adalah pada ikan betok 2
sebesar 130 % dan terendah pada gurame 2 sebesar.
III. PEMBAHASAN
Perbedan
jumlah DNA tiap sampel kemungkinan terjadi ketika pembuatan ekstraksi DNA kuang
mendapatkan supernatan DNA. Jumlah DNA pada ikan nila sebesarb 46 , betok belum
diketahui secara pasti (kisarannya 99-120), ikan gurame sebanyak 65 dan mas
sebanyak (kisarannya 60-100). Rasio muncul ketika terdapat perbedaan jumlah DNA
pada spesies yang sama.
IV.
KESIMPULAN
DNA dapat di ekstraksi menggunakan PCR-RAPD untuk
mendapatkan
sejumlah supernatan
untuk kebutuhan yang lainnya.
DAFTAR PUSTAKA
Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Geneitika. Bogor :
IPB Press
Adam,R.P., C.Hsieh,J.Murata,R.Pandey.2002.Systematics
of Junioperus from easter asia based on RAPDs. Biochem.sys. ceool 30:231-241
Jena,S.N.,A.B.Das.2006. Interpopulation variation of
chomosome and APD markers of Suaeda nudifloa (willid). Moq. a mangrove spesies
in India . African J. gric.Res 1 : 137-142.
Qian,W., Ge, S.,Hong, D.Y.2001. Genetic Vaiation
within and among populaions of a wold rice oryza granulata from China detected
by RAPD and ISSR markers. Theo . App. Genet. 102:440-449
Welsh J, McClelland.1990. Fingerprint genomes using PCR with arbitary primers.nucleic acid
res, 18: 7231-7218
Tidak ada komentar:
Posting Komentar